染色体标本制备经验实验手册

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染色体标本制备经验手册

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           上海欣谕仪器有限公司

            http://www.gy17.cn

  

     

 

 

第一部分

人类染色体研究的实验室建设………………1页

第二部分

各类器械清洗与常用试剂配置………………4页

第三部分

人类染色体标本制备方法……………………11页

第四部分

探讨染色体标本制备技术中的若干问题22页

第五部分

附录…………………………………………25页


第一部分

人类染色体研究的实验室建设

 

一、实验室要求

1、准备室(约30平方米):供清洗玻璃仪器、配制试剂仪器包装消毒及制片场所,还必需配置耐酸碱水池、实验操作台、药橱等设施。并能合理放置冰箱、电热干燥箱、离心机、纯水器、消毒锅、天平等仪器,以方便使用。

2、无菌室(约25平方米):用作细胞的接种培养、配备培养基。分为更衣室(约4平方米)、缓冲室(约6平方米)、接种室(约15平方米)。配备空调机、传递窗、离心机、倒置显微镜、超净工作台、臭氧发生器或紫外灯、培养箱等设备仪器。

3、分析室(15平方米):为观察分析核型、整理资料场所。配备高清晰度带照相装置的显微镜,电脑、打印机、办公桌等。

 

二、设备仪器

(一)仪器

1、超净工作台一台

2、光学显微镜二台(可以安装染色体软件分析系统)

倒置显微镜与带照相装置的正立显微镜各一台。倒置显微镜用作细胞培养;正立显微镜用作核型分析,有条件的单位可配备染色体分析软件、电脑、打印机等。

3、 隔水式恒温培养箱一台

开展产前检查的单位,最好购买二氧化碳培养箱。

4、电热干燥箱一台

5、冰箱二台:普通冰箱和低温冰箱各一台

6、酸度计一台(可略)

7、纯水器(电阻率18兆欧姆)一台;(可略)

8、高压灭菌锅一台(可略)

9、电热磁力搅拌器一台(可略)

10、真空泵(无油)一台(可略)

11、电子天平二台(万分之一天平与普通天平各一台)

12、水平式离心机二台

转速0-4000转/分,10毫升/管,大容量与小容量各一台。大容量的供制片用,小容量的放置无菌室供细胞培养用。

13、 可调移液器若干支:规格从5-5000微升若干支

14、超声波清洗器一台(可略)

15、水浴箱(0-100℃可调)

(二)玻璃器皿与耗材

1、培养瓶:15毫升链霉素瓶,25毫升小方瓶(建议采用一次性培养瓶)。

2、刻度离心管(10毫升)50支

3、量筒(10-1000毫升):各种规格各一个。

4、不锈钢滤器(各种规格各一个)及滤膜(孔径中0.25微米)一盒

5、注射器(1-20毫升)若干

6、盐水瓶(100-500毫升)若干

7、试剂瓶(磨口)10个

8、蒸馏水瓶(3万或5万毫升)2个

9、染色缸1个

10、研钵1个

11、酒精灯2盏

12、滴管(带吸头)50支

13、载玻片若干

14、试管架和离心管架各2个

15、各种镊子与剪刀若干

16、铝饭盒(供盛培养瓶滴管等器械消毒时使用)

17、烧杯(容量50-2000毫升)各一个

18、抽滤瓶(1000-2000毫升)一个

19、各种规格的可调移液器吸头若干

20、载波片盒(50-100片)若干

* 玻璃器材的材质应采用中性硬质玻璃或硼硅玻璃

三、常用药品及试剂

1、培养基(RPMI 1640、HamF10)

2、植物凝集素(phytohemagglutinin简称PHA)

3、肝素钠(抗凝剂,医用级)

4、血清(小牛血清、胎牛血清)

5、抗菌素(青霉素、链霉素)医用级

6、秋水仙素(秋水仙碱)

7、氧化钾(分析纯)

8、碳酸氢钠(分析纯)

9、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠(分析纯)

10、乙二胺四乙酸二钠(EDTA,分析纯)

11、三羧甲基氨基甲烷(Tris,分析纯)

12、 胰蛋白酶

13、 酚红

14、 姬姆沙染料(Giemsa)

15、 甲醇(分析纯)

16、 冰醋酸(冰乙酸)(分析纯)

17、 重酪酸钾(化学纯)

18、 浓硫酸(工业级)

19、 香柏油

20、 甘油(分析纯)

21、 乙醇(无水和纯度95%,化学纯)

22、 乙醚(无水,化学纯)

23、 生长因子(碱性成纤维细胞因子bFGF、表皮细胞生长因子EGF)

24、 氢氧化钠(分析纯)

25、 柠檬酸钠(分析纯)

 

 

 

第二部分

各类器械清洗与常用试剂配置

 

一、各类器械清洗处理

1、清洗液配置

清洗液配方

配方试剂

1

2

3

4

5

重鉻酸钾(克)

60

60

80

100

200

工业硫酸(毫升)

90

460

100

800

500

水 (毫升)

750

300

1000

200

500

方法:先将重酪酸钾溶于水中,再慢慢加入工业浓硫酸。

注意:配制时会产生高热,应采用耐高温材料配制。配制人员要做好防护措施(如配带保护眼镜、耐酸手套等)贮存清洗液的容器一定要带盖子,防止清洗液不断吸收空气的水分,而变质失效。容器的材质可选用陶瓷或耐酸硬塑。

* 配制时切记不能将水倒入硫酸里!配方3较为广泛使用。

2、玻璃器皿清洗

新的玻璃器皿先用清水冲干净,再在清洁剂(如洗衣粉、洗洁精等)溶液中,用毛刷彻底刷干净,然后清水冲净。晾干(如有超声波清洗器,可将器皿用清水冲净后放入超声波清洗器中清洗后,清水冲净晾干)。再用5-10%HCL(浓HCL原液浓度约36%)泡过夜后,冲净烘干,再泡入清洗液中24小时(注意泡入的器皿内不能有气泡),再用清水彻底冲净,然后用蒸馏水冲净(普通器皿冲五遍),用作细胞培养的器皿(如培养瓶等)蒸馏水冲净后,再用三蒸水冲两遍以上,烘干。用纯棉布或无毒的硬纸包裹,高压高温灭菌备用。旧的玻璃仪器的清洗,可免去中间用5-10%HCL浸泡过夜这一步骤,其余的处理方法仍要保留。

 

3、橡胶类制品的清洗

橡胶制品(如橡胶塞等)先用清水刷洗,再用2%NaOH煮沸20分钟,清水冲净过透。再用2%HCL煮沸20分钟后,自来水冲洗10分钟,用蒸馏水过三遍后,再用蒸馏水浸泡24小时,取出80℃以下烘干,包装消毒备用。

* 器皿的清洗是整个实验的关键性的第一步。

4、载玻片的清洗处理

把玻片逐片用皂粉液洗刷干净(用粗纱布刷,不要用毛刷)或逐片放入超声波清洗器内清洗后,自来水彻底冲净后,晾干。逐片放入清洗液中浸泡24小时,取出后用自来水彻底冲净,泡蒸馏水一天,取出放入盛有80%乙醇的容皿(带密封盖)内保存备用。

*玻片的清洁直接影响染色体铺展、形态及背景的清晰;玻片之间粘在一起时,密封程度高,皂液和清洗液无法侵入,故要逐片侵入。

5、金属器材

金属器材一般可用酒精擦净后,高压高温灭菌后备用,也可用含有0.5%亚硝酸钠的1:1000的新洁尔灭溶液中浸泡灭菌(30分钟以上)。

 

二、常用试剂的配制

1、培养基RPMI1640配制

培养基由多中氨基酸、维生素、生物素、无机盐等按不同比例配置而成,再加入酚红作指示剂是细胞体外培养的必要营养素。

称取10.4克RPMI1640干粉,加入新制备的三蒸水(电阻率18MΩ)900毫升,用磁力搅拌器搅拌约2小时(不能加热),使粉末充分溶解,用NaHCO3 (约2克)调PH=7.2(用PH计测量),再用1000毫升容器瓶进行定容,在无菌室内抽滤灭菌、分装,于4℃冰箱保存,长时间不用,应置-20℃冰箱保存。

 

2、培养基Ham F10配制

按说明书的量称取Ham F10干粉,配制方法和要求与RPMI1640的配制方法相同,不同之处是,用作羊水细胞的F10培养液体,用NaHCO3PH=6.7。而用作外周血培养基的F10培养液,则用NaHCO3PH=7.2。

* 配制培养基的蒸馏水一定要新鲜,纯度达18MΩ;配好后要尽快过滤灭菌,以免细菌大量繁殖影响培养液的质量。

3、抗凝剂

抗凝剂常采用的是肝素,肝素是一种多糖,能阻止白细胞和淋巴细胞与红细胞集结在一起而影响培养的质量,但肝素浓度太高会导致溶血。一般剂量是100单位肝素液可抗凝5毫升血液。

配制:取静脉注射用肝素安瓿一支(含12500国际单位),在无菌条件下,用灭菌生理盐水稀释25倍即500单位/毫升,分装备用。每管分装0.2毫升(即100单位),可抗凝5毫升外周血。也可用肝素钠粉剂(每毫克130单位)。取450毫升肝素钠溶于100毫升生理盐水,即为585单位/毫升。高压灭菌备用。

4、植物凝集素(phytohemagglutinin简称PHA)

PHA是从豆子(四季豆、鸡子豆、雪山豆等豆子都含有丰富的PHA)提取出来的,其化学成分为糖蛋白,具有刺激淋巴细胞进行有丝分裂的作用。PHA用量不足影响分裂细胞的数量,用量过高,则使培养的外周血凝集而影响淋巴细胞生长,使用前一定要清楚所使用PHA产品的正确用量,各厂家生产的PHA的活性存在着差异,故使用量有一定的差异。

配制:若购买已灭菌的PHA,可在无菌条件下直接用培养液(不含血清)溶解,按说明书上的使用量直接加入到培养液中。若购买的是未除菌的PHA粉末,则用生理盐水溶解后,再过滤灭菌后使用。

5、秋水仙素(Colchicine,纺锤体抑制剂)

秋水仙素是从地中海的一种名叫秋水仙(colchicum)的鳞茎中提取的一种植物碱,它的作用:

1)抑制细胞纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期,从而起到积累大量中期细胞的作用。

2)使染色体单体缩短分开,呈现明显的外形。秋水仙素的使用浓度范围比较宽,可差几十倍之多,一般终浓度为0.2-0.5微克/毫升。处理4-6小时。秋水仙素作用时间越长,被阻止的中期细胞越多,但染色体也会收缩,收缩过度会影响形态。

配制:称取秋水仙素4毫克溶于40毫升生理盐水,即配成100微克/毫升,高温高压灭菌后分装备用,5毫升培养物中加入0.01毫升或0.02毫升,使最终浓度为0.2微克/毫升或0.4微克/毫升。

秋水仙胺是人工合成的一种秋水仙素的衍生物,它的功效与秋水仙素是一样,但对细胞的毒性作用只是秋水仙素的几十分之一。

* 因秋水仙素具有一定的毒性和致癌作用,故配制使用时做好防护措施。

6、低渗液

低渗液的作用:能使细胞膨胀,便于染色体分散而易于观察和计数,常用0.075M KCL作低渗溶液,优点是:

1)染色体轮廓较清楚

2)染色性增强,可以缩短染色时间

3)用于G带技术更能显示其优越性

配制:称取2.795克KCL,加双蒸水至500毫升,溶解。4℃冰箱保存。

7、固定液

固定液的作用是稳定染色体的形态结构,清除染色体外层物质对染色体在玻片上展开的影响,通过更换固定液2-3次,清除红细胞的碎片,使标本片的背景更为清晰,广泛使用的固定液是甲醇和冰醋酸的混合物,二者的比例是甲醇∶冰醋酸=3∶1,现用现配。每次固定时间至少为30分钟,已固定的细胞在固定液中置冰箱4℃密封保存一个月也不会变质。

8、EDTA-胰酶消化液

用于消化贴壁生长的成纤维细胞,使细胞从瓶壁脱落便于收

 

集或传代培养。

配制:

1)贮存液:NaCl          8克

KCL         0.4克

葡萄糖        1克

NaHCO3      0.58克

胰酶          0.5克

EDTA         0.2克

依次溶于90毫升三蒸水中,并加入1%酚红0.2毫升作指标(也可以不加酚红),再加入三蒸水定量至100毫升,过滤灭菌,分装置-20℃冰箱保存。

2)工作液:

取贮存液1毫升加无菌三蒸水或培养液9毫升即可,EDTA最终浓度为0.02%,胰酶最终浓度为0.05%,处理时间约30秒左右(应以镜下观察细胞变圆即可终止作用)。

9、胰蛋白酶保存液(G显带)

1)0.25%胰酶液

称取胰酶2.5克,加生理盐水(或双蒸水)1000毫升,充分搅拌溶解(约2小时),按每份60毫升分装(根据G显带时所用的容器的容量来分,一般采用立式染片缸),冰冻保存。(使用方法见后)

2)2%胰酶液

称取胰酶2克,用100毫升生理盐水(或双蒸水)充分搅拌溶解,按每份5毫升分装冰冻保存备用。(使用方法见后)

* 胰酶的配制要注意两点:一是要充分溶解,这一过程一般会观察到溶液由混浊变澄清;二是配制时间也不能过长,常温下,胰酶液较容易受细菌污染,细菌数量太多,会影响胰酶效价。如果只是外用显带,不需要过滤除菌,但应尽快分装,冰冻保存。尽量降低细菌的污染程度。

10.磷酸缓冲液(浓度为0.07M,PH=7.4)

人类染色体较容易被碱性染料染色,采用偏碱的磷酸缓冲液

 

配成姬姆萨染色液染色,使得标本片中的染色体和细胞核呈现鲜艳的紫蓝色,其形态与带型更为清晰。

方法:

甲液:磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078克加双蒸水至1000毫升。

乙液:磷酸氢二钠(NaHPO4·2H2O11.876克(如果是带12个水分子的Na2HPO4·12H2O则称取23.87克)加双蒸水至1000毫升溶解。

取甲溶液18.2毫升、乙液81.8毫升混匀即配成100毫升PH=7.4磷酸缓冲液。

* 上述溶液都可以配好备用。只要没有出现沉淀物,匀可继续使用。于4℃冰箱保存,使用期会长些。

11.姬姆萨(Giemsa工作液

1)Giemsa原液配方:姬姆萨染料     1克

甘油          50毫升

甲醇          50毫升

方法:先将姬姆萨染料加少许甘油用研钵充分研磨,逐步加入余下的甘油,置55℃水浴2小时,并不断研磨搅匀,使其充分溶解。冷却后,再加入50毫升甲醇混匀。置带盖的瓶子中(经常摇动瓶子,使染料溶解得更好),两周后,用定性滤纸(或普通粗滤纸)过滤即可。另一方法:将染料边研磨边加足甘油后,室温下放置2天左右,期间要经常将其搅匀,再加入50毫升甲醇搅匀,两周后,用定性滤纸(或普通滤纸)过滤备用。此法免去了55℃毫升加热2小时这一步骤,但配制时间较长些。

* 因甘油和甲醇具有吸水性、挥发性,原液最好室温下密封保存。

2)工作液配方:姬姆萨原液:磷酸缓冲液=1:6(或以上)

* 工作液最好现用现配,各实验室的G显带方法各有差异,染料的质量也有差异,故工作液的稀释比例根据实际情况来定。一般情况下,浓度越高,染色时间越短;反之,则越长。过浓

 

稀都会影响显带的质量。

12.0.2 N盐酸溶液配制

称盐酸原液(约12N)HCL(AR)1毫升加双蒸水至60毫升,搅匀即可。

13.1%或5%氢氧化钡Ba(OH)2溶液

称取Ba(OH)2(AR)1克或5克,加双蒸水100毫升,加热溶解,冷却后若不溶物较多,可用粗滤纸过滤,4℃冰箱保存。

14.2 × SSC溶液

称取氯化钠NaCl(AR)17.54克,柠檬酸钠C6H5O7Na3(AR)8.82克,加双蒸水至1000毫升。

15.1%酚红溶液

称取酚红1克,置研钵中逐渐滴加0.05NNaOH 25毫升,不断研磨至颗粒完全溶解,再加入三蒸水至100毫升。


第三部分

人类染色体标本制备方法

 

一、人体外周血淋巴细胞染色体标本的制备(已经商品化

原理:人体外周血的淋巴细胞是一种已成熟的不具有进行有丝分裂能力的细胞,故不能直接用其制备染色体标本。但淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下,能转变为具有细胞分裂能力的母细胞。因此,外周血必须经过含有PHA的培养液培养后,才能制备供核型分析染色体标本。

1、淋巴细胞培养液配制

RPMI1640液     80%

小牛血清       20%

PHA            适量(根据厂家说明书的使用量)

肝素           100单位

双抗           100单位/毫升

细胞生长因子   适量

最后将配好培养液的酸碱度调PH=7.2-7.4,在无菌的条件下进行配制分装。然后进行分装,每瓶4.5毫升。冰柜保存。

2、采血与培养

用无菌注射器吸取0.2%肝素液0.2毫升(或100单位肝素)湿润针筒,抽取被检者静脉血约2毫升,轻轻转动针筒,使之与肝素混匀,再将解冻至37℃的培养液的瓶盖用酒精棉球擦净消毒,直接用注射器从瓶盖上插入,每瓶接种0.2-0.4毫升的外周血,摇匀后于37℃培养箱培养,如果外周血样本不需要保留,注射器不需吸取肝素,直接抽血,立即接种到培养瓶内,摇匀后培养。这一方法减少污染机会,同时降低肝素的用量(培养液中已含肝素),肝素量过大,会引起溶血。

3、 秋水仙素处理

加秋水仙素的时间根据检查目的而定。如果检查放射损伤后

 

染色体畸变应在培养44-54小时后加秋水仙素,这样可避免一部分畸变的染色体丢失;如果用于染色体疾病的诊断,则在培养66-70小时加秋水仙素,以积累更多的分裂中期细胞。

加秋水仙素的量在前面试剂配备中已讨论过,这里不作探讨。加入秋水仙素摇匀后,置37℃培养箱继续培养4-6小时,终止培养收集细胞。

4、 低渗处理

将培养物倒入10毫升的刻度离心管内,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。小心吸去上清,加入8毫升预热37℃的低渗液,用吸管将现溶物打匀,置37℃水浴15-20分钟。使白细胞膨胀,染色体分散,红细胞解体。

5、 预固定

低渗后,立即加入1毫升新配的固定液,轻轻打匀,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。

6、 固定

离心后弃上清,留下管底的细胞,缓慢加入固定液约8毫升并轻轻打匀,37℃水浴30分钟;第一次固定时,先加数滴,轻轻将细胞打匀,再慢慢加至8毫升,打匀,这样染色体标本的形态较好。平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。

7、 再固定

离心后,弃上清,加入8毫升固定液,打匀。于37℃水浴30分钟,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。

8、 制片

离心后,弃上清,根据沉淀的细胞量,加入适量的固定液打匀,将细胞悬液滴入1-2滴于预冻的干净玻片中央,随即吹气,轻轻过火,气干。

* 注意事项:

①器皿洗涤一定要干净,不能有酸碱残留。

②接种外周血不能太多或太少

③培养细胞温度37℃+ 0.5

④秋水仙素一定要避光保存,配制后使用期不能超过半年,

 

秋水仙素的处理时间不要少于4小时,也不要超过6小时。

⑤低渗的时间、温度会影响染色体的分散和分裂相的数目。

⑥离心机最好用水平式,转速过快过慢直接影响标本片的质量。

⑦固定液一定要现用现配,固定要彻底,每次不少于30分钟,加固定液不能过快,要沿管壁慢慢加入,否则染色体容易扭转;固定作用不足,染色体出现毛刷状。

⑧玻片的清洁度、冷冻温度会影响染色体的铺展

 

二、骨髓染色体标本的制备

骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者,特别是急慢性粒细胞的白血病的检查,也适用于淋巴细胞性白血病。骨髓细胞处于生长分裂期,可以直接取样制备染色体标本片,为了增加细胞的分裂相数量,可在加入秋水仙素的培养液中作短暂的培养。再收集细胞制备染色体标本片,会获得较满意的分裂相数目。

1、骨髓细胞短期培养法

培养液配方:RPMI 1640       80%

小牛血清        20%

双抗            100单位/毫升

肝素            100单位

配好后分装成每瓶5毫升,冰冻保存,用灭菌的注射器从髓骨抽取骨髓液0.2-0.4毫升,直接注入预热37℃的培养液中摇匀,37℃培养24-48小时后,加入秋仙素(10微克/毫升)0.1毫升,继续培养4-6小时,终止培养收集细胞。

低渗、固定、制片等步骤与外周血染色体标本制备相同。

2、骨髓细胞直接制片法

用灭菌的注射器从隋骨抽取骨髓液0.3-0.5毫升,立即注入含秋仙素0.1-0.05微克/毫升的生理盐水(5毫升)中,用滴

 

管轻轻吸动,将骨髓的脂肪颗粒充分洗掉,平衡离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟,弃上清。加入含同样秋水仙素浓度的生理盐水2-3毫升,37℃放置2-3小时,平衡离心,时间速度同上,弃上清。加低渗液5毫升,打匀后37℃水浴10-15分钟,离心弃上清,固定、制片的方法按外周血染色体标本制备进行。

3、注意事项:

1)骨髓染色体标片制备的成败,首先取决于骨髓液,抽取骨髓太少或太稀,细胞数量过少,不易获得较多的中期细胞,要进行核型分析就更困难了。故要足够的骨髓量和细胞数。细胞数量要求达3×106/毫升。通常作短期培养能增加细胞数目,提高成功率。

2)骨髓材料中脂肪颗粒较多,必须充分洗掉,否则影响标片的质量。

 

三、羊水细胞染色体标本的制备

羊水细胞染色体标本制备技术,目前已广泛应用到临床产前检查中。羊水中的细胞量少,且大多是老化细胞,因此不能直接制备染色体标本,羊水细胞的培养是实验成功的关键。

1、羊水穿刺取材:(略)

在有条件的医院,由专业医生在无菌安全条件,准确定位,取出羊水20-30毫升。

2、羊水细胞培养:

培养液配方:Hams F10培养液        80%

胎牛血清                 20%

细胞生长因子             适量

双抗                     100单位/毫升

PH=6.6-6.8,无菌条件配制,分装冰冻备用。抽取的羊水在无菌条件下,平衡离心,离心速度1000-1200转/分钟,时间8-10分钟,弃上清,留下1毫升上清与沉淀的细胞打匀,接种到25毫升方形的培养瓶内,加入5毫升预热37℃的羊水培养液,轻轻打匀,置37℃培养箱(最好采用CO2培养箱)。静止培养6-7天。接种量,通常10毫升羊水的细胞接种一瓶。

3、6-7天后,镜下观察细胞生长情况,若羊水细胞已贴壁,并形成许多细胞小岛,即进行换液。

4、换液时,轻轻吸去旧的培养液,加入新鲜的培养液5毫升

5、细胞换液后生长加快,隔日观察,当细胞生长旺盛,出现许多透亮圆形饱满的细胞时(一般约为14-30天),可收集细胞进行染色体制片。

6、若换液后,细胞生长缓慢,仍旧只有几个孤立细胞小岛,或者细胞形态只有成片的树皮状的细胞,无圆形的细胞出现。就要进行原瓶传代或换瓶传代:倒去培养液,加入1-2毫升EDTA胰酶,于37℃作用1-2分钟,轻轻吸去胰酶液,加入5毫升培养液,轻轻将细胞打匀,或换上新瓶或用原来的瓶,37℃静止培养,3天后观察细胞,细胞生长旺盛,出现较多双圆形细胞时可进行染色体制片。

7、收集细胞前5-6小时,加入秋水仙素,终浓度为0.1微克/毫升,或或收集细胞前16-18小时,加入秋水仙素,终浓度0.02-0.05微克/毫升,37℃继续培养。

8、倒去培养液,加入EDTA胰酶1-2毫升。镜下观察胰酶作用情况,当细胞收缩变圆时候,立即轻轻倒去胰酶,加入5毫升生理盐水,轻轻将瓶壁的细胞吹打脱落,平衡离心速度1000-1200转/分。时间8-10分钟。弃盐水上清。然后进行低渗处理,低渗、固定、制片等步骤与外周血染色体标本制备基本相同,所不同的是,低渗液、固定液的每次使用量每管3-5毫升,以减少细胞损失。由于羊水细胞易破,故操作的力度一定要轻,只能用气吹打,不能吸打。

* 注意事项:

①抽取妊娠16-20周的羊水最好,月份过小羊水不足,月份过大羊水细胞老化不易培养成功。

 

②抽羊水前翻动孕妇的身体,以取得较多的羊水细胞。

③培养液的胎牛血清的质量十分关键。

④培养开始4天内不要翻动,以免影响细胞贴壁

⑤收集细胞的时机要掌握好,生长不够旺盛的,形态成树皮状的细胞收不到分裂相,只有生长旺盛且呈现较多圆形透亮的细胞时,才能收到较多的中期细胞。

 

四、染色体显带技术

染色体显带技术常用的有荧光Q-带、Giemsa G-带、异染色质的C-带等。这里介绍较为常用的Giensa G -带C-带技术。

1、G-显带染色体标本的制备

方法一:

1)将配制好的0.25%的胰蛋白酶溶液60毫升倒入立式染色缸内,37℃水溶预热,用3% Tris调PH=7

2)将标本片浸入胰酶溶液中,不断轻轻摆动,新鲜标本只需处理3-9秒钟,老标本则需处理3-5分钟。

3)立即投入1:10或1:20的Giemsa工作液,染色15-20分钟

4)自来水冲净,气干。

方法二:

1)45毫升生理盐水或双蒸水倒入立式染色缸内,加入已配好的2%胰酶液5毫升,用3% Tris溶液调PH=7于37℃预热。

2)把染色体标本片浸入37℃上述胰酶工作液中,略加摇动,处理30秒左右。

3)取出后立即用1:10Giemsa工作液染色8-10分钟,自来水冲净。

* 注意事项:

①胰酶的品质会直接影响显带的质量,购买品牌试剂较保险。

②胰酶的活性与PH值和温度有关,在PH=7温度37℃状态

 

下,胰酶活性最高。

③胰酶处理时间长短与标本片片龄有关,新鲜的标本处理时间短,且带纹较清晰,建议标本片的片龄在2-7天内较适宜。

④Giemsa工作液要现用现配

⑤胰酶工作液长时间置37℃水浴,容易浑浊污染,应弃之。

2、C-带染色体标本的制备

C显带特点:对染色体中的结构性异染色质容易染色,对常染色质只能显示较淡的轮廓。C显带所显示着色较深的结构部位:①各染色体的着丝粒;②各近端着丝粒的部位;③在1、9、16号染色体具有次缢痕的位置上;④Y染色体的长臂远端,此部分系Y染色质部分。其它部分着色很淡。

核型分析过程,对某些染色体变异问题,往往需要C显带技术与G显带技术结合分析,更能准确判断染色体的畸变。

方法一:

1)将常规制备染色体标本片放入0.2NHCL溶液中,室温下,处理15-30分钟。

2)自来水冲净后,再将标本片浸入预温到65℃的5% Ba(OH)2溶液中,处理10分钟。

3)自来水冲净后,再把标本片投入预温到65℃的2×SSC溶液中,处理1-1.5小时;

4)自来水冲净后,用1:10 Giemsa工作液染色0.5-1小时。

5)自来水冲净,气干。

方法二:

1)将制好的标本片放入0.2N HCL中,室温下1小时。

2)水洗净(均用自来水冲洗)

3)浸入1% Ba(OH)2水溶液中,温度预热到50℃,处理时间15-20秒。

4)水洗净

5)浸入预温到60℃的2×SSC溶液中,处理90分钟。

6)用水彻底冲净;

 

7)1:10 Giemsa染色液染色10-15分钟

8)水冲净、气干。

* 注意事项:

①标本片年龄不能超过一个月

②各种处理溶液一定要达到所需的温度时,才放入表本片进行处理

③每一步处理后,要立即用自来水彻底冲净后,才进行下一步处理。

3、R带技术

1试剂

pH6.8PBS:溶液A——1/15mol/LKH2PO4、溶液B——1/15mol/LNa2HPO4。pH6.8PBS为1000毫升A液加900毫升B液。

Earles液:溶液A—NaCl6.80克、KCl0.40克、NaH2PO4·H2O0.14克、蒸馏水800毫升。

溶液B—无水CaCl20.20克、MgCl·6H2O0.17克、蒸馏水200毫升。

将溶液A倒入溶液B中,混合后即可。

Hoechst-33258原液:Hoechest-332582毫克,蒸馏水4毫升。

Hoechest工作液:200毫升1/15mol/LPBS加0.75毫升原液。

吖啶橙(acridineorange)

配制pH6.5PBS:

溶液A——0.07mol/LNa2HPO4·12H2O、溶液B——0.07mol/LKH2PO4。将32毫升A液和68毫升B液混合。

吖啶橙工作液:0.1克吖啶橙于100毫升0.07mol/LPBS中。

胸腺嘧啶核苷(Thymidine):使最终浓度为每毫升为0.3毫克。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU):使最终浓度为3×10-5mol/L。

2.显带步

 

1)所制标本在Hoechst工作液中,浸染20分钟或在吖啶橙工作液中浸染5分钟,再用PBS冲洗2次。

在同步比培养细胞时,进行BrdU处理,使BrdU在DNA复制时渗入到胸腺嘧啶的位置,又因BrdU是一种淬灭剂,凡有BrdU的区域都能使吖啶橙和Hoechst荧光染料减弱,这对于显带清晰有帮助。

2)标本上铺满1/15mol/LPBS,放在45铁板上,用8W紫外灯,灯距为5厘米,照射15—20分钟后,蒸馏水洗2次。

紫外光的照射造成邻近胸腺嘧啶形成二聚体,即TT,这样减少了AT间的氢键,使富于AT的DNATm值下降,也就是这部分的DNA更易变性。

3)标本在86水浴锅中的Earles液中处理1—2分钟后,蒸馏水洗2次。处理时间和气温及标本龄、光照有关。

R显带过程中的热处理是重要的步骤,86是适宜的温度,使富于AT的DNA变性而使富于GC的DNA保持原状。

4)用pH6.8PBS配制5%Giemsa染色5—10分钟,水洗,空气干燥。

5)在显微镜高倍目镜下检查显带标本(见图26-1,C),R带是与G带相反的带型,R带是富于GC碱基对的DNA,是S期早复制的DNA,而其带间是富于AT碱基对的DNA,是S期晚复制的DNA。在显微镜下可以看到比G带更明显的带型,另外大部分染色体端部为深染,还有若两条X染色体中的一条为晚复制时,呈淡染。这对于染色体间易位和对X染色体失活和晚复制关系的研究将有独特的功能。若在显微镜下呈现一片淡染,可考虑光照时间和处理时间两者之比例。

4、染色体脆性位点显示技术

1)试剂

培养液:93毫升mol/L199+5毫升透析小牛血清+1毫升2mol/LHepes+1毫升10-5mol/LFUdR+2×104单位青霉素、链霉素,pH7.6—7.8。

氨甲喋呤(amethopterin),使最终浓度为10-7mol/L。

 

BrdU,使最终浓度达3×10-5mol/L。

秋水酰胺,最终浓度为每毫升0.07微克。

2)标本制备

人体培养细胞在培养瓶中汇合三分之二时,淋巴细胞培养至72小时,加入氨甲喋呤,最终浓度为10-7mol/L,继续进行同步化培养17小时,用Hanks液清洗2次,加入新鲜培养液,在淋巴细胞换入的培养液中仍需含有PHA,但在换入培养液去掉FUdR,而加入BrdU,最终浓度达3×10-5M,继续培养5小时,随即加入秋水酰胺,最终浓度为每毫升0.07微克,2小时后按常规收细胞,空气干燥制片。

3)显示脆性位点:用pH6.8PBS配制3%Giemsa染色10分钟,水洗,空气干燥。

4)镜检:在显微镜高倍目镜下观察100个分裂中期有3—30个染色体上发现有脆性位点(见图26-1,D),主要特征为具有宽度不等的非染色裂隙,常涉及两个染色单体,此外,可出现无着丝粒片段缺失以及三相交换体征象(friradialfigure)脆性位点可能是富含胸腺嘧啶的DNA节段,因此当脱氧胸苷三磷酸库(dTTP)耗竭时,可造成这一节段在有丝分裂时不能紧密折叠,甚至出现裂隙或断裂,表现出镜下可见的脆性位点。如在细胞培养液中去除叶酸和胸腺嘧啶,或加入二氢叶酸还原抑制剂(如氨甲喋呤)和5-氟脱氧尿嘧啶核苷(FUdR)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),可使脆性位点细胞表达频率明显增高,说明脆性位点的产生与DNA的这一合成代谢过程受阻有关。此外培养液的pH对提高脆性位点的检出率是非常重要的。因为在不同pH条件下,叶酸具有不同的离子形式,其进入细胞的运转速率也就不同,而胸腺嘧啶的摄入同样受pH的影响,因此在选择适当培养液的同时注意pH的影响。

5、Giemsa分化染色技术

1)试剂Giemsa原液制备(参见P8

2)标本制备

常规制片,细胞悬液滴片时为一般片的1/3密度。用乙

 

-0.2mol/LHCl洗一下标本。

(3) 显色过程

标本浸在60蒸馏水中2小时。

制备染色液,47毫升pH11.3,0.05mol/LPBS+3毫升Giemsa原液,混和后用滤纸过滤,在37水浴锅中预温。

标本浸到37Giemsa染液中1—6分钟、标本龄长时适当延长染色时间。

镜检:在显微镜高倍目镜下观察,灵长类的染色体呈现淡蓝色,伴有一些特定的异染色质呈品红色。啮齿类染色体会被染成品红色。

 

五、实验结果

通过染色体分化染色,可以在染色体上显示出各种带型及脆性位点,有利于对染色体遗传病的诊断,尤以X染色体长臂末端2区7带和2区8带之间或附近的一个特定脆性位点,它表现了非特异性X连续的智力低下,被称为脆性X染色体综合症,可以给于叶酸治疗,这一发现将会使许多不明原因的智力低下患者得以诊断和治疗。Giemsa11带又可用于人类细胞和啮齿类细胞融合后所得杂种细胞的检定。再者染色体分化染色一般公认为是DNA与蛋白质的相互作用,而且显带是一种染料特异现象,为此染色体分化染色不仅是一个具有巨大价值的实用手段,而且对染色体组成的特定水平也将提供重要资料。

 

 


第四部分

探讨染色体标本制备技术中的若干问题

1、为什么有的培养基的颜色较深,有的较浅?

: 培养基的红色来自成分中的酚红,因为它的变色范围较适合作培养基的酸碱度指示剂。它在PH≥7时,颜色由红变深紫色,PH≤7时,颜色则由红色逐渐变成黄色。外周血的培养液PH=7.2-7.4。另外,不同厂家出厂的同一种培养基,因配方的酚红含量各有差异,使培养液的红色深浅略有差异,但不影响培养效果。

2、为什么外周血培养时间要68-72小时?

: 外周血淋巴细胞在体外培养中,受到培养液中的PHA刺激,获得有丝分裂能力,经过68-72小时的培养后,大多数淋巴细胞进行了三次分裂增殖,数目达到制备标本片的要求。培养时间过短,细胞量不足,培养时间过长,细胞老化,营养耗尽,又浪费时间。实验证明,68-72小时的培养,效果最为理想。

3、有的标本片,分裂相很多,但染色体“瘦小”,是不是培养液营养不良引起?

: 淋巴细胞一定要在良好的营养环境中才能生长增殖,分裂相多,说明了淋巴细胞生长旺盛,染色体“瘦小”,是因为在制片过程中,染色体的蛋白结构发生异固缩造成的,起因可考虑为以下几个原因:

① 秋水仙素浓度是否过高,或处理时间是否过长?

② 加固定液的速度不要过快,有时瞬间的固定,会使蛋白结构产生固缩现象。

③ 固定液中的甲醇、冰醋酸是否有质量上的改变。

④ 可以适当加大固定液中的冰醋酸的比例,如甲醇∶冰醋酸=3∶1.5(或2)

4、配备好的培养基一般能保存多长时间?

: 培养基保质期与贮存温度有关,贮存温度在-20℃(普通冰

 

箱冰格层)可以保存半年至1年;贮存温度在-70℃以下,可以保存1-2年。

5、培养基的接种温度对细胞培养有影响吗?

: 接种前,应该将培养基预热至37℃才接种。若培养基接种温度低于4℃,容易造成细胞破裂(尤其是红血球)。影响培养效果;另外培养基的接种温度如果低于10℃,往往造成细胞进入半休眠状态,影响细胞培养周期,使分裂相减少。

6、抽取的外周血是否需要抗凝?

: 我们配制的培养基已含有肝素,若待检的样品可以立即接种不需保留的,抽血时不需添加抗凝剂。方法是将抽取的外周血立即接种到培养液中,马上摇匀后放到37℃培养箱中培养。若待检的样品不能马上接种或要保留样品的,应抽血前加入适量的抗凝剂,抽完血后马上摇匀,再进行接种。

注意:抗凝剂过多会影响培养效果(在前面的试剂介绍中已讨论过)。

7、抽取的血液样本能保留多长时间?

: 首先强调的是,外周血的样品越新鲜培养效果就越好,一些特殊病例需要保留样品作备用,应将添加过抗凝剂的外周血样品放在4℃-10℃冰箱中保存,保存期为3天左右。超过七天后接种,培养效果很差。

8、经制片后的细胞悬液能保存多长时间?

: 细胞悬液可密封后保存在4℃或-20℃,4℃保存一个月内,-20℃保存2年内滴片制成的标本片仍可进行G显带;-20℃保存3年细胞悬液仍可进行荧光杂交。

9、为什么外周血培养过程中有时会出现凝血现象?

: 在实验过程中下列原因可能会导致培养后的血液出现凝血现象:

①培养液中的PHA含量过高。

②培养液中的肝素使用量不足或效价下降。

③接种后,没有立即降外周血与培养液充分摇匀。

10、为什么外周血培养有时会出现溶血情况?

 

: 在实验过程中下列原因可能会导致培养后的外周血溶血:

①细菌污染。

②PHA和肝素过量。

③外周血样品不新鲜。

11、为什么有个别样品出现不明原因的无分裂相的现象?

: 由于有个别病人可能服用过抑制白细胞分裂增殖的药品(如白血病病人),这类病人的样品往往经培养后,白细胞仍受到药物抑制而不进行分裂增殖,因此标本片很难找到分裂相,建议停药一个月以上再作染色体检查。


第五部分

  

 

一、染色体实验应用

1.姐妹染色体交换核型分析

2、职业病等微核分析

3、染色体遗传病分析

4、白血病病人诊断参考分析

5、细胞生物学教学

6,染色体脆性观察

二、染色体实验用品报价单  

组建染色体实验室和染色体分析系统请参考公司网站。

 

 

三、 联系方式

网址: http://www.gy17.cn      邮箱:sj_gy17@163.com

电话: 021-51093712

 


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